Condiciones ambientales y de nutrientes óptimos para el desarrollo del microorganismo hidrocarbonoclasta Penicillium sp. in vitro

Introducción

A nivel mundial es de trascendental importancia la explotación de los recursos energéticos. En el caso de México, el petróleo crudo es su principal fuente energética (INEGI, 2009), logrando una extracción total de 2.6 millones de barriles diarios en el año 2009: 77.5 % fueron extraídos de los pozos en el mar del Golfo de México (Cruz-Serrano, 2010), y el 22.5% se extrajo de los pozos en tierra. La mayoría de los pozos en tierra se encuentran ubicados en el estado de Tabasco, de donde se obtuvo el  77% del total de petróleo extraído de los pozos en tierra (Hernández, 2009), correspondientes al 3.7 % del Producto Interno Bruto (PIB) total nacional (Arias, 2010). La industria petrolera sufre continuamente de accidentes que originan derrames de petróleo, contaminando los ecosistemas terrestres y marinos, impidiendo con ello el aprovechamiento de los recursos naturales afectados y problemas de salud en la población humana (Levin y Gealt, 1997; Eweis et al., 1999). Es por ello que se han estado desarrollando estudios en técnicas de biorremediación para estos sitios, a fin de hacer esfuerzos para abatir estos serios problemas que afectan la ecología y la salud humana.

La biorremediación utiliza el potencial metabólico de los microorganismos para limpiar ambientes marinos y terrestres abiertos contaminado, siendo una técnica adecuada para la industria petrolera porque es de aplicación simple sobre grandes áreas y lleva a la destrucción completa de los hidrocarburos contaminantes (Castro-Riquelme, 2008). Dentro de la biorremediación, la bioaumentación involucra la inoculación de una cepa o consorcio microbiano mixto enriquecido en la tierra o en el agua (Kuiper et al., 2004; Ogbulie et al., 2010), donde se ha señalado que los microorganismos indígenas son más eficaces para degradar petróleo crudo local o sus derivados locales, que para degradar hidrocarburos provenientes de otras regiones (Gesinde et al., 2008). Los microorganismos indígenas, están presentes en cantidades muy pequeñas y por ello no tienen la capacidad para degradar un contaminante en particular o pueden encontrarse en formas metabólicas inactivas en sus hábitats. La bioaumentación ofrece una manera de proporcionar microbios específicos en número suficiente para completar la biodegradación (D’Annibale et al., 2006). Se ha reportado que los hongos son mejores que las bacterias en la degradación de hidrocarburos tanto en cantidad como en variedad de constituyentes, siendo los géneros  Aspergillus y Penicillium los que se encuentran con mayor frecuencia en suelos y aguas marinas contaminados con hidrocarburos (Chávez-Gómez et al. 2003; Valenzuela et al., 2006; Castro-Riquelme, 2008; Ogbulie et al.,  2010). Estos hongos toleran a los hidrocarburos y crecen en ellos, porque producen enzimas y ácidos que rompen y desarman las cadenas largas de los hidrocarburos, la estructura base común a los aceites, productos derivados del petróleo y muchos otros contaminantes (Launen et al., 1995, Wunder et al., 1997; Isitua e Ibeh, 2010). Es por ello que se ha utilizando  el Penicillium sp. en estudios sobre la biodegradación de petróleo crudo (Mittal y Singh. 2009; Okoro, 2008; Obire et al., 2008; Leitão, 2009; Obire y Anyanwu, 2009; Ogbulie et al., 2010), o derivados del petróleo con el mismo fin (Jeonge-Dong and Choul-Gyun, 2007; Castro-Riquelme, 2008; Leitão, 2009; Isitua e Ibeth, 2010; Machín-Ramírez et al., 2010), y sobre la mineralización de una variedad de compuestos derivados del petróleo, tales como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), incluidos pireno, criseno, y el benzo [a] pireno, a metabolitos polares (Kiehlmann et al., 1996; Sing, 2006; Leitão, 2009;  Isitua and Ibeh, 2010; Machín-Ramírez  et al., 2010), así como en estudios de toxicidad con diferentes hidrocarburos, puesto que la biodegradación puede no llevarse a cabo por la toxicidad del hidrocarburo más que por la persistencia del mismo (Castro-Riquelme, 2008). Se ha señalado la presencia del hongo Penicillium sp. en suelos contaminados con hidrocarburos en diversas partes y ambientes en el mundo, como por ejemplo: en Kwait (Radwan et al.,1995), Canadá (April et al.(2000), África (Gesinde et al., 2008; Nkwelang et al.,2008; Isitua e Ibeth, 2010; Ogbulie et al., 2010), Chile (Valenzuela et al., 2006), y Korea (Jeonge-Dong y Choul-Gyun, 2007), entre otros.

En lo relativo a las condiciones de Temperatura, Nutrimentos y pH para el desarrollo óptimo del Penicillium sp., varios investigadores han señalado temperaturas de 30 ºC o 31 ºC (Castro-Riquelme, 2008; Leitão, 2009), aunque Corry (1987) y Lacey (1989) reportaron que en nueve especies de Penicillium la temperatura media óptima de crecimiento fue de 28 ºC. Sin embargo estudios recientes  han recomendado un intervalo de 28 ± 2 ºC para el crecimiento óptimo del Penicillium sp. (Isitua e Ibeh, 2010). Respecto a los nutrientes, en necesario proporcionar C, N, P, K y oligoelementos. Según reporta Ercoli et al. (2000), la fuente de oligoelementos ayuda a mejorar el proceso de biodegradación de hidrocarburos. Respecto al pH, Alexander (1994) ha recomendado en pH = 4.0 para el crecimiento óptimo de los hongos. Los resultados obtenidos por Sanchis et al. (1992), en su estudio sobre Penicillium griseofulvum, mencionaron que el pH de entre 3.5 y 4.5 es el óptimo para su crecimiento.

El hongo Penicillium sp. ha demostrado su alto potencial en el campo de la biorremediación, sin embargo no ha recibido la atención adecuada para su aplicación en proyectos a gran escala (Leitão, 2009). Es por ello que el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar cuales son las condiciones óptimas medioambientales y de nutrientes que puedan favorecer el mayor desarrollo biomásico de este microorganismo, a fin de ser un aporte en el diseño de nuevas estrategias en biorremediación por bioaumentación sobre suelos contaminados con petróleo crudo o derivados del petróleo, tanto en México como en el Mundo.

Materiales y métodos

Etapa 1. Aislamiento, caracterización y adaptación de hongos hidrocarbonoclastas

Se colectaron muestras de un suelo contaminado de un campo petróleo del Municipio de Huimanguillo, estado de Tabasco en México, ubicado a una altitud de 20 msnm (INEGI, 2001). Se tomaron muestras simples de suelo de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana 021 (NOM-021-RECNAT-2000, 2002), para una superficie total de 5 000 m² (0.5 ha), y se conservaron a 4.0 ºC hasta su uso. A continuación, se determinaron los Hidrocarburos Totales del Petróleo (HTP) presentes en las muestras de suelo por el método de Extracción (EPA-3540C, 1996; EPA-9071B, 1998), en su fracción pesada (hidrocarburos con un numero de átomos de carbono mayores de C18), y posteriormente se cuantificaron por gravimetría (EPA-1664A, 1999). Las muestras de suelo fueron sometidas a siembra en la Fase I.

Fase I: El aislamiento de los hongos totales se llevó a cabo en el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa PDA (Baker), preparado de acuerdo con el fabricante y adicionado en placas petri. Se preparó una disolución con 10.0 g del suelo muestreado en 90 mL de agua destilada estéril, a partir de la cuál se prepararon dos diluciones seriadas (Madigan et al., 2003), obteniéndose diluciones 10^-1 y 10^-2. Posteriormente, se sembró 0.1 mL de cada dilución por separado en 6 cajas petri con PDA, esparciéndola con la espátula de Drigalsky y se incubaron a 28 ºC por 8 días (d). Luego se cuantificaron hongos totales por el método del recuento en placas por dilución seriada (Madigan et al., 2003). De entre 14 cepas de hongos aisladas, se escogieron las 5 de mayor crecimiento radial: H14, H18, H19, H20 y H24, para ser evaluadas como hidrocarbonoclastas en la Fase II. Las cepas se inocularon en tubo inclinado con PDA y se preservaron a 4 ºC hasta su uso.

Fase II: Cultivo en medio Sólido Agar Celulosa (SAC) para hongos hidrocarbonoclastas. El medio SAC (Baker) se preparó  de acuerdo con Rivera-Cruz et al. (2002), y se adicionó a placas petri. Los medios de cultivo, el petróleo crudo Istmo fracción pesada (C>18), con índice API = 33.74 (PEMEX, 1988), y papel filtro de 1 cm², se esterilizaron durante 20 min a 121 ºC (Madigan et al., 2003). Por otro lado, se re-sembraron las cepas de hongos obtenidas de la Fase 1, tocando con un asa el micelio de cada colonia preservada, se esparcieron en PDA esterilizado y se incubaron a 35 ºC por 72 h. A continuación se colocó un cuadro de 1.5 cm² de papel filtro impregnado con petróleo crudo sobre en medio SAC de cada placas petri, se extrajo con un saca-bocado (0.9 cm de diámetro) una rodaja de hongo con estructura reproductiva de las cepas resembradas, se colocó sobre el papel filtro impregnado con petróleo en el medio SAC y se tapó la placa petri (Rivera, 2001). Cada cepa se sembró por triplicado en el medio SAC y se incubaron a 29 °C por 6 d. Las cepas H14, H18 y H24 presentaron mayor desarrollo radial, y pasaron a la siguiente Fase.

Fase III: Adaptación de hongos en medio mineral Líquido Agar-Celulosa (LAC) para hongo hidrocarbonoclastas. El medio LAC fue preparado de acuerdo con Johnson y Curl (1972). Se incorporó petróleo crudo al medio LAC, como fuente de carbono y energía de acuerdo con Rivera-Cruz (2001), luego se sembró cada cepa por separado, considerando lo señalado por Rivera-Cruz et al. (2002), y se incubó por 6 d. La cepa H24 mostró mayor desarrollo y se eligió para ser evaluada en la Etapa 2. Esta cepa se identificó como Penicillium sp. por medio de un micro-cultivo, empleando las claves de Barnett y Hunter (1972). Este hongo fue preservado en medio PDA a 4 ºC en tubo inclinado.

Etapa 2. Desarrollo del diseño experimental para
determinación de parámetros de desarrollo óptimo

Se empleó el modelo estadístico Y ijk=µ+Ti+Nj+pHk+TiNj+TipHk+NipHj+Eℓ(ijk), para la implementación del bioensayo experimental in vitro con arreglo de factores 3x3x2, consistente de las temperaturas: T1=29°C ,T2=35°C y T3=40°C; los pH`s: pH1=3.5, pH2=5.0 y pH3=6.0; y los fertilizantes nutricionales: N1=Urea y N2=Nitrofoska-Azul. Las temperaturas de 35 ºC y 40 ºC se establecieron en baños con calentador eléctrico. Los parámetros de nutrimentos y pH se determinaron en matraces Erlenmeyer de 250 mL distribuidos en tres series de 6 tratamientos, conectados a un compresor con filtro de membrana y controlador de válvulas para suministro de aire estéril.

Preparación de los medios de cultivo. Los medios nutritivos utilizados fueron: N1=Urea (Abbot), y N2=Nitrofoska-Azul 12-12-17-6 NPKS (Compo), preparados con igual proporción de C, en base a la misma cantidad de glucosa (Merck), adicionada a cada medio. Los medios tuvieron la relación de proporcionalidad de nitrógeno N siguiente, Urea:Nitrofoska-Azul aprox. 9.5:1; en cuanto a la proporción de fósforo P y potasio K, se tomaron las informadas por Hernández Rivera et al. (2011), donde se cumple proporción entre Triple-17:Nitrofoska-Azul, P (2.8:1) y K (1:1), respectivamente, ya que la Urea no proporciona P ni K.  Así mismo, la carga en masa fue la misma para ambos fertilizantes orgánicos. Los medios se prepararon de la siguiente manera: para cada uno de los se prepararon tres matraces Erlenmeyer con 500 mL de agua destilada (Química Mercurio) y 2.5 g de glucosa como fuente de carbono. El primer medio contenía 0.25 g de Urea y 0.25 g Nitrofoska, haciendo un total de  6 matraces. Posteriormente a cada tipo de estos medios nutritivos se les ajustó el pH a 3.5, 5.0 y 6.0 respectivamente, utilizando disoluciones 0.1M de H2SO4 (J.T. Baker) y de NaOH (J.T. Baker). Para evaluar los medios nutritivos a cada temperatura, se midieron por triplicado 150 mL de cada medio nutritivo con su pH ajustado y se colocaron en un matraz de 250 mL, obteniendo 18 unidades experimentales (u.e.), de acuerdo al diseño experimental. Las u.e. fueron  esterilizadas  durante 20 min a 121 °C y 103.421 kPa (15 lbf plg^-2). Estas u.e. fueron posteriormente inoculadas con Penicillium sp.

Preparación del inoculante. El Penicillium sp. preservado (Fase III de Etapa I), se re-aisló en placas petri en el medio PDA como se señaló previamente y se incubó a 35 ºC por 4 d. A continuación se adicionaron 5 mL de agua destilada estéril al tubo inclinado. La suspensión anterior se vació en un matraz Erlenmeyer con 100 mL de agua estéril y se determinó la concentración inicial de esporas por conteo en cámara Neubauer de acuerdo con Pica et al. (2004). De este medio inoculante, se inyectaron 2.5 mL en cada una de las 18 u.e. y de manera inmediata se determinó la cantidad inicial del inóculo como UFC de Penicillium sp.  al tiempo cero días (t=0 d), por el método de celular viables (Madigan, 2003). La evaluación de la multiplicación del hongo en las u.e. se realizó cada 2 d durante 37 d por el mismo método. Los valores de pH y de temperatura se determinaron diariamente.

Resultados

Se realizó un estudio sobre un suelo contaminado con 4.0×10⁵ mg kg^-1 HTP (400,000 ppm) de petróleo crudo (API = 33.74), con la finalidad de encontrar y aislar microorganismos degradadores de hidrocarburos para emplearlos en la producción de biomasa fúngica. El Cuadro 1 muestra 14 cepas de hongos obtenidos en la fase de aislamiento microbiano (Fase 1 de la Etapa 1), de las cuales se seleccionaron las 5 que tuvieron mayor crecimiento radial en el medio de cultivo PDA para continuar con su evaluación en la Fase II.

De las 5 cepas seleccionadas de la Fase anterior, sembradas en el medio de cultivo SAC para hongos degradadores de HTP (Fase II), las cepas nombradas como H14, H18 y H24 mostraron un mayor desarrollo y pasaron a la Fase III (Cuadro 2).

En el Cuadro 3 (Fase III), se presenta el crecimiento de los tres hongos seleccionados en la Fase II, en el medio LAC. Se observó el comportamiento de la rapidez de su reproducción a través del tiempo (6 d). Así mismo, se verificó visualmente el rompimiento de la tensión superficial del petróleo crudo cambiando completamente su apariencia física.

Estos resultados permitieron clasificar a las tres cepas de hongos como hidrocarbonoclastas. De estas cepas, la nombrada H24 e identificada como Penicillium sp. por comparación con las claves de Barnett y Hunter (1972), tuvo el mayor crecimiento durante el tiempo que duró el experimento,  y fue seleccionada  para ser evaluada en la Etapa 2.

En la evaluación del crecimiento de Penicillium sp. en matraz (Etapa 2, Fase I), se observó un aumento en la viscosidad del medio de cultivo en el transcurso del crecimiento biomásico. Con los datos obtenidos se realizó la prueba de medias. La Figura 1 muestra los resultados obtenidos en los tratamientos a diferentes temperaturas, nutrimentos y pH.  La Figura 1A indica que la multiplicación de Penicillium sp. fue mejor a la temperatura de 29 ºC, y un poco menor en las otras dos temperaturas. La Figura 1B señala que el microorganismo se desarrolló más en el medio con el fertilizante Nitrofoska-Azul, manifestando una diferencia significativa en comparación del medio con Urea. En la Figura 1C se muestra que el desarrollo poblacional de Penicillium sp. a un valor de pH de 3.5 fue significativamente superior al de los pH´s de 5.0 y 6.0, mientras que la diferencia entre éstos dos últimos no mostró diferencia notable.

La Figuras 2 muestra los resultados de tres tratamientos para cada medio nutritivo que presentaron el mayor crecimiento poblacional de Penicillium sp. de acuerdo con el diseño experimental. La cantidad de microorganismo al t=0 h fue de 4500  UFC mL^-1. Se observó que el mejor resultado se obtuvo con el medio N₂=Nitrofoska-AzulpH₁=3.5T₂=35°C, con un máximo de crecimiento poblacional de 4.28×10⁶ UFC mL^-1 a los 20 d. Los siguientes mejores tratamientos fueron (en orden decreciente de desarrollo fúngico): N₂=Nitrofoska-AzulpH₃=6.0T₁=29°C (3.18×10⁵ UFC mL^-1 a los 13 d), N₂=Nitrofoska-AzulpH₂=5.0T₁=29°C (2.92×10⁵ UFC mL^-1 a los 33 d), N₁=UreapH₁=3.5T₁=29°C (8.9×10⁴ a los 25 d), N₁=UreapH₃=6.0T₁=29°C (5.8×10⁴ a los 9 d), y N₁=UreapH₂=5.0T₁=29°C (4.1×10⁴ a los 22 d). La multiplicación máxima de los medios preparados con Nitrofoska fue superior a los preparados con Urea.

Mientras que la Figura 3 es una ampliación de la figura 2, que no incluye el tratamiento N₂=Nitrofoska-AzulpH₁=3.5T₂=35°C.

Discusión

El estudio se realizó sobre un suelo Gleysol-mólico del estado de Tabasco en México, contaminado por más de 20 años con petróleo crudo (Zavala et al., 2003). La cuantificación de HTP dio un valor de 4.0×10⁵ mg kg^-1 HTP. El Cuadro 1 muestra 14 cepas fúngicas, de las cuales las denominadas H14, H18, H19, H29 y H24 presentaron mayor desarrollo poblacional en el medio PDA y fueron sembradas en el medio SAC, donde H14, H18 y H24 mostraron mayor crecimiento (Cuadro 2), y pudieron considerarse  como cepas especializadas y degradadoras de hidrocarburos, según Atlas et al. (1991) y Adams-Schroeder et al. (2002),  por su poder de adaptación en suelos contaminados con HTP (Cerniglia y Heitkamp, 1987; Heidelberg et al., 2002; Leitão, 2009). A continuación, estas 3 cepas fueron sembradas en el medio LAC, donde H24 presentó el mayor crecimiento poblacional (Cuadro 3),  y fue clasificada como Penicillium sp. de acuerdo con Barnett y Hunter (1972), y con Mier et al. (2000). Esto se puede atribuir a que el Penicillium sp. posee en la membrana un grupo específico de oxigenasas asociado a la producción de agentes de superficie (Lee y Levy, 1989; Walton et al., 1994). Sin embargo, hasta el momento sólo se puede hablar del potencial del Penicillium en el campo de la biorremediación, puesto que no se encuentra información relativa a la generación de biomasa fúngica de este hongo hidrocarbonoclasta con miras a su aplicación en biorremediación de petróleo crudo en suelos, es decir, no se encuentran reportados estudios a gran escala (Leitão, 2009).

Posteriormente se estableció el experimento en el laboratorio para la determinación de los parámetros óptimos de crecimiento fúngico. El Penicillium sp. presentó pigmentación roja en los tratamientos con urea, coincidiendo con Méndez-Zavala et al. (2007). Al respecto Cho et al. (2002), han informado que la fuente de nitrógeno marca un efecto muy significativo sobre la expresión de los pigmentos. Alexander (1994), indicó que los microorganismos presentan el crecimiento óptimo en un rango de temperatura de 28 a 39 °C. Varios investigadores han señalado temperaturas óptimas para el desarrollo del Penicillium sp de 30 ºC o 31 ºC (Castro-Riquelme, 2008; Leitão, 2009). Por su parte, Corry (1987) y Lacey (1989) reportaron que en nueve especies de Penicillium la temperatura media óptima de crecimiento fue de 28 ºC. La Figura 1A muestra que Penicillium sp produjo el mejor desarrollo poblacional a una temperatura de 29°C (Tukey α≤0.05), lo que esta de acuerdo con Isitua e Ibeh (2010), quienes han recomendado un intervalo de 28 ± 2 ºC para el crecimiento óptimo del Penicillium sp. Respecto a los nutrientes, se registraron evidencias estadísticas significativas (Figura 1B), resultando el mejor crecimiento  en el tratamiento con Nitrofoska-Azul (4.28×10⁶ UFC mL^-1), lo que se atribuye a contiene P y K, elementos que no proporciona la Urea. La Figura 1C presenta diferencia estadística significativa (Tukey α≤0.05), con mayor población de 1×10⁵ UFC mL-1 en el tratamiento  pH₁=3.5. Según Alexander (1994), los hongos  presentan el crecimiento óptimo en medio con agar a un pH de alrededor de 4.0. Los resultados obtenidos por Sanchis et al. (1992), en su estudio sobre Penicillium griseofulvum, mencionaron que el pH óptimo se encuentra en un rango de 3.5 a 4.5. Sin embargo, Hussein y Abdel-Fattah (2002), han indicado como 7.0 el valor de pH para el crecimientos óptimo en sus estudios sobre Penicillium sp. Con estos datos se procedió a planificar el diseño experimental a fin de determinar las mejores condiciones de desarrollo del Penicillium sp., y así emplear el tratamiento más eficiente en la obtención de biomasa fúngica hidrocarbonoclasta.

Las Figuras 2 y 3 muestran el desarrollo fúngico obtenido en los 6 mejores tratamientos del diseño experimental consistente de 18 u.e. Todos los medios tuvieron un rápido desarrollo microbiano los dos primeros días, llegando a un orden de magnitud de 10⁴, para luego continuar su adaptación en cada medio en el mismo orden de magnitud de manera paulatina, previo a su desarrollo exponencial, logrando un máximo en el mismo orden de magnitud que la meseta previa para el caso de la Urea, pero para el caso de Nitrofoska-Azul el máximo llegó a 10⁵ (N₂pH₃T₁ y N₂pH₂T₁) e incluso de 10⁶ para el medio N₂pH₁T₂. Posteriormente, en cada tratamiento disminuyó la población fúngica, alcanzando una meseta que continuaba disminuyendo la cantidad de microorganismo hasta su eliminación o término del estudio. Los tratamientos a base de Nitrofoska-Azul lograron la mayor multiplicación del Penicillium sp por sobre los medios preparados con Urea. El mejor de todos los tratamientos fue el denominado N2pH₁T₂ con 4.28×10⁶ UFC mL^-1 a los 20 d, el segundo mejor medio fue el N₂pH₃T₁ con 3.18×10⁵ UFC mL^-1 a los 13 d,  correspondiente al 7.43 % del desarrollo poblacional microbiano logrado con el medio N₂pH₁T₂. El mejor medio con Urea, logró un a multiplicación fúngica correspondiente al 2.08 %  del N₂pH₁T₂ (N₁pH₁T₁, con 8.9×10⁴ UFC mL^-1 a los 25 d). Finalmente, el sexto mejor medio (N₁pH₂T₁, con 4.1×10⁴ UFC mL^-1 a los 22 d), alcanzo 0.96 % del desarrollo logrado por el medio N₂pH₁T₂.

Los resultados expuestos en esta investigación, el estudio sobre la obtención de biomasa bacteriana en biorreactor por Hernández et al. (2011), y el costo del fertilizante Nitrofoska-Azul (bulto de 50 kg: Urea 21.34 dollar, Nitrofoska-Azul 61.04 dollar),  dan soporte para recomendar la obtención de biomasa fúngica empleando el fertilizante Nitrofoska-Azul, por sobre la Urea.

Conclusiones

La investigación sobre un suelo Gleysol-mólico del estado de Tabasco en México, determinó que estaba contaminado con 4.0×10⁵ mg kg^-1 (400,000 ppm) de HTP. Este suelo se muestreó, y se aisló y caracterizó el hongo hidrocarbonoclasta Penicillium sp. La adaptación del microorganismo en dos medios nutricionales: Urea y Nitrofoska-Azul, a tres temperaturas y tres pH, sirvieron para diseñar un experimento completamente al azar. En base a los resultados obtenidos del diseño experimental, se encontró que el tratamiento  con Nitrofoska-Azul, pH de 3.5 y a una temperatura de 35 ºC (N₂pH₁T₂), presentó el mejor crecimiento poblacional a los 20 d con 4.28×10⁶ UFC mL^-1. Por lo anterior y considerando los costos de los fertilizantes y estudios previos de nuestro equipo de investigación, se recomienda el empleo de estas condiciones experimentales para la obtención de biomasa fúngica, a fin de que sea considerada en una estrategia de biorremediación por bioaumentación sobre suelos contaminados con petróleo crudo, y contribuir así a dar solución al problema de los suelos contaminados con hidrocarburos en México y en el mundo.

Agradecimientos

Esta investigación forma parte del proyecto POA-2008011, “Determinación de los Parámetro Óptimos de Crecimiento para la Producción de Biomasa Bacteriana y Fúngica Hidrocarbonoclasta”, desarrollado por la División Académica de Ingeniería y Arquitectura (DAIA) de la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco (UJAT), con financiamiento parcial por parte de la empresa Corporativo de Servicios Ambientales S.A. de C.V. (CORSA). Los autores agradecen a la DAIA de la UJAT por el apoyo para llevar  a cabo el presente trabajo de investigación, al Ing. Alfredo Castro Betancourt, Gerente General de CORSA S.A de C.V. por la gestión del financiamiento otorgado al proyecto, a los señores Mauricio Kohan Rubio y Cristián Contreras Radovic, Decano de la Facultad de Salud y Ciencias A. F. y Director de Investigación, respectivamente, de la Universidad Internacional SEK, por las facilidades otorgadas para la organización y conclusión del presente documento.